Cultivo in vitro

Una muestra de los diferentes pasos a seguir con el fin de multiplicar plantas mediante este sistema. Además: cómo elegir el explante, los medios y el ambiente de cultivo. Por Luz Marina Lucero*

La constante búsqueda de diferentes formas y colores llevó a la industria de la floricultura a procurar nuevos cultivos y especies. Actualmente, en la propagación vegetal, se recurre cada vez más a la biotecnología con el propósito de mejorar las técnicas de producción y solucionar los problemas surgidos en los procesos existentes, tales como la obtención de material vegetal libre de contaminaciones.

Los sistemas de propagación tradicionales no satisfacen la demanda de muchas especies vegetales, y la aplicación del método señalado asegura un número casi inimaginable de individuos idénticos a la planta madre y disponible todo el año partiendo de unas pocas células. También, para algunas especies endémicas y/o en peligro de extinción, la propagación in vitro puede ser una vía alternativa de rescate y conservación (en general, estas plantas pueden estar envejecidas, y el enraizamiento de estacas es casi imposible; asimismo puede ocurrir que el número de plantas sea muy escaso o sus semillas vanas o inviables).

A pesar de ello, la biotecnología aún no cumple con todas las expectativas para determinados cultivos; por ejemplo, para aquellos cuyos tejidos sufren de “bajo metabolismo”, debido o asociado a temperaturas extremas (bajas o altas), o sensibilidad a la deshidratación de sus semillas. Estos tienen poca probabilidad de propagarse; para solucionar estas dificultades, se continúa con la búsqueda de métodos que permitan lograr un mayor número de plantas sanas y con capacidad de desarrollarse en condiciones naturales de cultivo.

La micropropagación es una de las aplicaciones de mayor impacto dentro del cultivo de tejidos vegetales, y se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales. Se define como la multiplicación asexual, basada en la totipotencia vegetal, realizada en condiciones in vitro y totalmente asépticas (ambiente estéril).

La totipotencia vegetal indica que cualquier célula vegetal contiene una copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece, sin importar su función o posición en ella, y, por lo tanto, posee el potencial para regenerar una nueva planta completa. El proceso involucrado en la transformación de una célula en una planta u órgano, actualmente, se denomina organogénesis.

Una de las razones para tener en cuenta al momento de adoptar la técnica es que ofrece una serie de ventajas sobre la propagación convencional. Para la floricultura, es primordial tener propágulos de alta calidad, disponibles todo el año, en cantidad, excelente sanidad y vigor, que impacte tanto en la sustentabilidad del negocio como en su economía.

La obtención de plantas mediante micropropagación involucra una serie de etapas o fases:

• Selección de plantas madre: serán aquellas que se encuentren sanas y vigorosas, y se recomienda usar algunas partes que estén en activo crecimiento, como lo son las regiones meristemáticas (puntas de tallos y raíces, yemas, porciones de hojas).

• Establecimiento aséptico: consiste en sembrar en un frasco con medio de cultivo las porciones vegetales seleccionadas, previamente sometidas a desinfección y en un ambiente estéril (flujo laminar). En esta etapa, se espera que, una vez transcurrido un plazo que va de siete a diez días, el material inoculado esté libre de contaminaciones (hongos y bacterias). Para la desinfección, se usan productos de uso común, por ejemplo, el cloro, detergente, yodo povidona, alcohol, agua oxigenada, agua destilada y estéril.

• Multiplicación: en esta etapa, se aguarda que el tejido sembrado que supera la etapa anterior comience a diferenciar nuevos tejidos o brotes y así dé comienzo a la producción a gran escala.

• Proliferación a través de subcultivos periódicos: implica dividir el tejido obtenido y recultivarlo en nuevos frascos para la obtención de plantas diferenciadas.

• Enraizamiento: se puede realizar in vitro o ex vitro (fuera del tubo de cultivo). Muchas especies forman raíces dentro de los frascos y estas están listas para ser extraídas (Spathipyllum, orquídeas, helechos), pero las que no lo están, como muchas leñosas (azaleas, ficus, lavandas),  deberán ser inducidas a  través de la incorporación de hormonas enraizantes en un nuevo medio de cultivo.

• Aclimatación: ocurre una vez que se han obtenido las plantas completas; entonces, pueden ser extraídas del frasco y comenzar así su adaptación al nuevo ambiente. Es en esta etapa en la que pueden malograrse muchas plantas a consecuencia de la falta de control ambiental, dado que ellas aún no tiene la cutícula desarrollada y la pérdida del agua de sus tejidos es incontrolable.

El lugar de adaptación no deberá tener pérdidas de humedad (túnel), y la temperatura para esta fase será levemente más baja que la del cuarto de cultivo, sería ideal que oscilara entre 20 y 23ºC. Con la ventilación diaria, en diez días, los propágulos estarán listos para salir a enfrentar la etapa de vivero.

Al  fragmento de tejido u órgano vegetal que se toma para la inoculación o siembra se lo llama explante; estos participan de diversa naturaleza: pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas.

A continuación, se mencionan los explantes más destacados y de los que depende el éxito de la técnica:

El explante

• La elección del explante dependerá de cuál es el objetivo del cultivo:

Obtención de plantas con sanidad controlada: es muy común la utilización del cultivo in vitro para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (esto depende de la especie, de 0,2-0,5 mm de longitud), consistente del domo y de un par de primordios foliares (por ejemplo, clavel, crisantemo, rosa, Anthurium, Spathiphyllum, etc.).

Micropropagación: si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes (azalea, lavanda, Scindapsus, helechos, etc.), como así también, porciones de hojas (Begonia, Saintpaulia, Gloxinia, Streptocarpus, etc.). En este caso, el cultivador de tejidos debe conocer, perfectamente, la biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos.

Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios: para esta finalidad, los explantes pueden ser semillas (por ejemplo, orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo, como en el caso de la yerba mate o de algunas variedades de duraznero.

Obtención de plantas haploides: se obtienen a partir de un tejido sexual, femenino o masculino. En este caso, los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados (por ejemplo, rosa china y petunia).

Inducción de variación somaclonal: es un fenómeno natural que ocurre en los procedimientos de cultivo de tejidos, a través del cual pueden recuperarse mutantes seleccionados con resistencia y/o tolerancia a enfermedades. En este caso, es posible utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su uso es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes empleados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras (tomate, soja, maíz, papa).

• La edad fisiológica del explante:

Este es un aspecto muy importante para tener en cuenta dado que el vigor condiciona la velocidad de respuesta. Como regla general, puede decirse que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Por ello, los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con aquellos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar pretratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

• El tamaño del explante:

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante, también aumentan las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Existe un tamaño mínimo del explante: los meristemas se toman de 0,2-0,5 mm de longitud; las microestacas de 1 a 5 mm de longitud; las estacas de hoja de 1 a 2 cm2.

• La época del año en que se toma el explante:

Es un factor que está asociado al grado de dormición presentado por ciertos explantes (las yemas, por ejemplo) y también, a la posibilidad de mayor o de menor proliferación de microorganismos. En el supuesto de las leñosas, en las que es muy marcado el ritmo de actividad y su dependencia con la época, el desconocimiento de la fisiología del vegetal acarrearía grandes pérdidas económicas; por ejemplo, el retraso de la diferenciación cuando el explante está inducido a floración (azalea, hortensia, rosa, frutales como ciruelos, duraznos, cerezos).

Los medios de cultivo

El medio de cultivo está compuesto por una mezcla de sales minerales, macro y microelementos, indispensables para la nutrición del tejido: sacarosa, que provee la energía para los procesos metabólicos de cada una de las etapas mencionadas; vitaminas y reguladores de crecimiento para desencadenar los procesos de multiplicación, y agua destilada. Puede estar en forma de líquido o gelificado con agar-agar. Los medios más conocidos son los de Murashige&Skoog (Begonia, Saintpaulia, Gloxinia, Streptocarpus, helechos), Vacin&Went (orquídeas); Knudson (azaleas)  y son muy sencillos de preparar.

Es importante destacar que numerosas investigaciones dan respuestas a la búsqueda de la formulación de los medios de cultivo para utilizar en cada caso. La fórmula del medio cambia según el objetivo del cultivo; si lo que se desea es obtener tejidos diferenciados (hojas, tallos, raíces) o si se busca la obtención de tejido calloso (masa de tejido sin diferenciación de órganos, para luego ser sometidos a múltiples divisiones) y así obtener un mayor número de individuos.  Para los casos mencionados, toman un papel destacado las auxinas y citocininas, tipo y concentración de estos reguladores del crecimiento, que se suplementan al medio de cultivo.

Una vez seleccionado, preparado y envasado el medio en los frascos, estos se esterilizan en un autoclave para lograr la asepsia total de ellos.  

El ambiente de cultivo

También llamado cuarto de cría, es el lugar donde se colocarán los frascos sembrados para cumplir con el resto de los procesos.

Este lugar deberá ser limpio, claro, con control lumínico y de temperatura. El fotoperíodo o cantidad de horas luz a entregar, y la temperatura,  dependerán del tipo de cultivo que se esté tratando, en general,  se usan 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, y la temperatura media es de 23ºC+/- 2ºC. Los frascos se colocan sobre estanterías que portan tubos de luz fría.

En este cuarto, también en un sector preparado, puede llevarse a cabo la primera etapa de rustificación o aclimatación de las plántulas recién sacadas de los frascos, en contenedores adaptados para tal fin.

* Tec. Luz Marina Lucero, docente a cargo de la asignatura Cultivo de tejidos vegetales, correspondiente a la Tecnicatura Universitaria en Floricultura de la UBA. Directora: Ing. Agr. M Sc. Libertad Mascarini.

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